量公式（1）说明极化强度是由激发光场和介质相互作用而产生的，它不仅与入射到介质中的激发光场的光场强度有关，还与介质的极化率有关。在非线性光学中，这些线性和非线性极化率与介质的微观特性有关，代表了介质的光学性质，反映了介质的电子态、分子的对称性、旋向及排列等，因此介质的微观结构信息可以通过探测介质非线性光学现象来获得。二次谐波产生过程是和频过程的一种特殊情况，即倍频。倍频效应是指两个频率相同的入射光发生和频作用，其输出光波的频率为入射光场频率的二倍，其中入射光波称为基频，输出倍频光波称为二次谐波。相应的极化强度为：

二次谐波产生需要满足两个条件：一是要求介质要具有非中心对称性。在电偶极子近似下，具有中心对称性的介质，其二阶电极化率张量为零，则不能产生二次谐波信号。二是要求满足相位匹配条件。相位匹配直接决定一个非线性光学过程的效率。如果二次谐波产生过程中完全满足相位匹配条件，则传播中的倍频光波和不断产生的倍频极化波之间保持相位的一致性，相互干涉，产生的二次谐波强度由零开始逐渐增大，直至基频波的功率完全转为二次谐波的功率，获得最大的二次谐波输出功率。

二次谐波显微成像装置由四个部分组成：第一部分是光源，通常需要提供功率适中的激发光，既可以保证产生较强的二次谐波信号，也可以避免样品受损。在二次谐波显微技术中光源通常采用可在整个红外区内可调谐的掺钛蓝宝石飞秒激光器。第二部分是物镜，可以减小激发光的激发区域，并收集样品产生的非轴向辐射的二次谐波信号，避免能量损失。通常采用数值孔径足够大的物镜。第三部分是滤光片组，可保证收集到的信号为二次谐波信号，过滤干扰信号。在前向探测模式中，通常采用短通滤光片和窄带滤光片，在背向探测模式中，通常采用窄带滤光片。第四部分为信号探测系统，可以进行二次谐波信号的收集探测。通常采用高灵敏度的PM T探测器，或与激发光源同步的信噪比高的锁相放大器。

不同于其他的现代光学显微成像技术，二次谐波显微成像技术由于利于样品的非线性特性产生的二次谐波信号进行成像和探测，因此，具有以下主要特点：

①传统的激光共焦显微镜采用共焦小孔成像，二次谐波显微成像产生的信号光由于非线性效应的强局域特性被局限在焦点附近很小的区域里，在成像过程中非焦点区域发光对测量结果的影响大大减小，因此，它不采用共焦小孔就可以实现高分辨率成像，还具有较高的信噪比，具有较高的三维空间分辨率，并且可以对具有一定厚度的样品进行层析成像。

②在二次谐波显微成像技术中，通常激发光源采用近红外的飞秒激光器，这样减小了对生物样品的光损伤，降低了光漂泊，增加了样品的穿透深度。

③二次谐波信号是样品的原发性信号，成像过程不需要使用染料进行染色，这样避免了光化学毒性及染色过程中的物理损伤，没有染色过程也使该技术可用于很多被测样品不能进行荧光标记的成像探测。

④利用二次谐波信号进行成像或探测时，二次谐波信号的相干性使其对样品局部微观结构具有较高的敏感性，因此探测到的二次谐波信号不仅能反映与样品有关的强度信息，还可以反映样品的分子取向、排列方式等局部微观结构，这些重要而本质的信息可以通过分析信号的角度分布或偏振特性等得到。

⑤二次谐波显微镜虽未商品化，但双光子荧光显微系统已经商品化，二次谐波成像显微镜可以很容易地在其基础上经过简单改造获得，如通过更换滤光片改造而成，耗费较小。

⑥二次谐波成像显微镜可以收集背向信号，可以和其他的成像技术进行同时探测，如双光子荧光显微镜、光学相干层析成像，实现多通道显微成像或探测，更加有利于进行成像结果对比研究，实现信号互补。

在生命科学领域，二次谐波显微成像技术由于其无光损伤、无光毒性、无光漂白等特点，在生物组织成像中有广泛的应用。研究表明，一些结构蛋白如胶原蛋白、肌动球蛋白复合、微管蛋白等，都具有很强的二次谐波信号，不同的胶原蛋白类型在同等激发条件下，呈现不同的二次谐波信号强度，因此二次谐波显微成像技术可以用于生物组织的结构蛋白成像。生物细胞和组织成像也可以通过二次谐波显微成像技术实现，Shi-W eiChu等人曾用此技术观察到了斑马鱼体内细胞分芽繁殖、原肠胚的形成、组织的形成等晶胚发育过程 。Andrew等人用苯乙烯基染剂产生二次谐波 信 号 ，研 究 发 现 其 对 膜 电 压 的 敏 感 度 达 到40/100m V。二次谐波成像可以实现膜之间分离距离的测量，测量的精度比其他显微镜都高。不仅如此，根据二次谐波信号对分子分布的对称性的依赖，可以实时观察膜上分子的动力学变化规律，这比通常使用的核磁共振更加方便快捷。因此二次谐波显微技术在膜成像和动态测量中有重要的应用 。另外，二次谐波显微成像可以对基因组DNA溶液、细胞核提取物、培养细胞的细胞核等不同DNA样品进行检测，获取DNA样品的二次谐波信号并进行高解析度成像 。

在医学研究领域，二次谐波显微成像技术在肿瘤、皮肤科、牙科等研究方向都有广泛的应用。二次谐波显微成像技术能探测到子宫颈、口腔、食道、耳朵、鼻子等处的粘膜组织的病变，为肿瘤的诊断和分析提供了一份很好的参考，在癌症的早期诊断中能起到一定的作用。另外，通过二次谐波显微成像可以实现药物通透性的活体监控。二次谐波显微成像技术可以实现牙齿的成像，为牙科提供了一种新的光学诊断方法。此外，该技术还可以在不损伤角膜的情况下观察到角膜的结构，以及实现对眼底视网膜的成像研究。

在材料科学领域，二次谐波显微成像技术在纳米材料方向中也有广泛的应用。二次谐波显微成像技术可以对单个有机纳米晶体的取向进行探测，从而判断纳米晶体的晶体类型，也可以通过分析二次谐波信号的偏振特性来分析氧化锌薄膜的结晶品质和晶体生长取向，还可以通过偏振分析和离焦成像的方法获得单个KTP纳米粒子的三维取向信息和晶轴的欧拉角 。对于中心对称材料，其表面由于对称性遭到破坏而可以产生表面二次谐波信号，不仅能反映各向同性媒质属性，还可以反映长程有序材料的晶体结构。

二次谐波成像

二次谐波（SHG）是二阶非线性过程，它是基于双光子激发荧光显微镜之上； 双光子激发荧光显微镜不需要共焦针孔就可以实现三维高分辨率，并且其激发的激光在组织中的穿透深度大，因此成像深度比较大。针对生物组织，二次谐波信号成像还具有如下特点，如：

①二次谐波是生物组织原发性信号，从而光致毒性、光损伤和光漂

白这些致缺点对其而言就不复存在了。

②SHG 是相干散射过程，所成的像能反映出样品内部的细微结构。

③二次谐波的光谱宽度完全由激发光源决定，此点很重要，因为各

种信号干扰就会被有效消除了，从而获得较高的图像分辨率。

④在无外加染料的情况下，生物组织的成像依旧完好。

SHG 成像在生物组织的应用现状

Denk 与 Webb 等人于 1990 年首次展示双光子激发荧光显微成像，之后双光子显微镜 (Two-photon Microscopy) 在生物医学领域得到广泛应用，是研究光与组织间的物理和生物效应、细胞之间的相互作用、细胞内生化成分和离子浓度的变化等的有力工具。

1998年，Peter T. C. So 及其研究成员 对穿孔的鼠耳进行双光子深度分辨成像，并进行 3D 图像重构，获得了的皮肤结构符合组织病理学已有的结论，即角质细胞在上皮层，胶原和弹力纤维在真皮层，软骨在皮下的皮肤结构。

2001年，Fernando A. Navarro 研究小组 利用双光子共聚焦显微镜观察几内亚小猪皮肤创伤修复情况，并与传统的使用苏木精和伊红染色剂的二维显微图像比较发现，双光子共聚焦显微镜能够得到三维重构图像。 实验还使用化学试剂或胶带剥离角质层后进行观察，发现双光子共聚焦显微镜图像能达到更深的基细胞层， 真皮与上皮交界层，清楚地分辨角质细胞，基细胞和胶原纤维。 对伤口修复的研究表明，创伤时角质层通常是不存在的，因此移除是没有必要的。

2002年，Steven R. Beanes 等人 运用共聚焦显微镜观测不同孕育期的胎鼠创伤，实验发现：胎鼠伤口在孕育期从无疤痕到有疤痕修复的转变主要受创伤的大小和胎儿孕育时间的影响。 该实验小组早期主要是利用组织液培育切割的离体的母鼠创伤模型。 该模型在仿真伤口修复中有明显的缺陷，即不能完整修复真皮缺损，仅仅是表皮再生，部分真皮修复发生。 而且血液产生的因子，比如细胞活素，激素，血小板对伤口修复的影响将无法分析。 至此，没有离体皮肤伤口修复的模型能完整模拟真皮的修复。

2005年，R.Cicchi 等人 研究发现利用光透明剂对组织的不同成分的影响程度不同和光透明剂渗透进组织后会导致组织的局部脱水，就可以增强光在组织中不同成分间分布的差别，从而提高二次谐波成像的成像对比度。 得出了光透明剂在提高生物组织双光子荧光显微成像深度的同时也提高了成像对比度的研究结论。

2007年，Iris Riemann 等人 [6] 通过基于飞秒激光近红外脉冲的多光子层析成象系统 DermaInspect 观察除痣后人体真皮创伤的愈合和疤痕的形成。 通过内源荧光团的自体荧光和胶原的二次谐波 (SHG) 能观测修复过程中主要胶原纤维的聚合。 实验发现修复过程中深层的乳头状层和基层似乎向上移动， 14 — 15 天乳头状层中的出现纤维， 28~35 天纤维量达到最大。 同时还发现垂直伤口闭合方向出现大量胶原纤维结构。 实验表明 DermaInspect 系统能够观察创伤愈合不同时期细胞组织结构的自体荧光和胶原纤维沉积，将成为皮肤科医生诊断和检测治疗效果有利的工具。

2008年，Jason N.Rogart 等利用多光子显微镜来决定激发胃肠黏膜的最佳激发波长，得到用 735nm 激发，能够出现多光子自体荧光强度峰值；而且与共聚焦显微相比，多光子显微检测得到的细胞内的微细结构更加清晰，像上皮细胞核、杯状细胞、异色纤维和细胞等结构的分辨率相当于标准的 H&E 染色组织学结构。该研究显示，多光子显微镜可以在细胞水平上检测肠胃黏膜组织， 且不需要任何荧光染料，为活检技术提供大量实用的参考依据。

2010年，Hongchun Bao 等人 利用紧式显微内镜，获取体内的二次诣波成像，从而达到实时监控体现胶原的含量和结构的目的。 胶原变化对于不同疾病的早期诊断具有很重要的意义。 本研究首次通过光纤维将非线性显微内镜应用于二次诣波成像。 高分辨的二次诣波成像可揭示出蛋白和胶原的结构，并确定结构的方向和维度。

2011年，Naoyuki Morishige 等人 通过二次谐波获得胶原片层的三维结构，而人眼角膜前基质的胶原片层的结构是角膜硬度的决定因素，此对眼疾的诊断和治疗有着重要的意义。

基于二次谐波信号成像的非线性光学成像技术 , 能够为生物组织的早期无损诊断提供有效的方法 , 然而由于组织的浑浊特性使其对可见光和近红外波长具有很强的散射效应 , 导致基于激光的治疗和诊断技术受到很大限制。 使用光透明剂 ( 甘油等 ) 提高组织内部的折射率匹配从而降低散射效应的方法能够非常有效地提高生物组织二次谐波成像深度和对比度 , 有望在生物医学领域得到广泛应用。