更新时间：2024-03-08 16:27
酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：（1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；（2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；（3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免活力损失。
1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：
（1）质粒DNA：X μL（约1 μg）。
（2）限制性内切酶：1 μL（约10 U）。
（3）10×buffer：2 μL。
（4）ddH2O：补足20 μL。
2. 混匀，做好标记。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 min中止反应。
5. 电泳检测酶切效果。
三、双酶切
1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：
（1）质粒DNA：X μL（约1 μg）。
（2）限制性内切酶1：1 μL（约10 U）。
（3）限制性内切酶2：1 μL（约10 U）
（3）10×buffer：1或2 μL。
（4）ddH2O：补足20 μL。
2. 混匀，做好标记。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 min中止反应。
5. 电泳检测酶切效果。
四、结果与分析
假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点， 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果，则单酶切应为一条带， 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值，那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。